迷走神经是最大的自主神经，几乎为身体的每个器官提供神经支配。“迷走神经张力”是一种临床测量指标，被认为能表明迷走神经活动的总体水平，但它是通过心率变异性（HRV）间接测量的。异常的 HRV 与许多严重疾病有关，如糖尿病、心力衰竭和高血压。然而，迷走神经张力从未被直接测量过，导致其解释存在分歧，并影响了迷走神经疗法的有效性。使用定制的碳纳米管纱线电极，我们能够在麻醉和非麻醉的大鼠中长期记录左侧颈迷走神经的神经活动。在此，我们表明，无论是在麻醉还是非麻醉状态下股市如何配资炒股，迷走神经的紧张性活动与常见的 HRV 指标均无相关性。尽管我们发现吸气时的平均迷走神经活动比呼气时增加，但这种与呼吸相关的信号也与 HRV 无关。这些结果不仅代表了神经记录技术的明显进步，也表明需要重新解释 HRV 与“迷走神经张力”之间的联系。

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一、介绍

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自主神经系统负责内脏器官活动的潜意识控制和感知。它最近成为了诸如“生物电子医学”等新型治疗技术的研究重点。迷走神经是最大的自主神经，几乎支配着人体内的每一个器官。其广泛的神经支配使迷走神经成为治疗干预的目标，迷走神经刺激疗法已被用于治疗多种疾病，从癫痫到类风湿性关节炎再到抑郁症。

尽管在这些疾病中尚未直接测量迷走神经活动，但心率变异性（HRV）是一种临床测量指标，被认为可以评估迷走神经活动，通常称为“迷走神经张力”。异常的迷走神经张力与许多严重疾病相关，如糖尿病、心力衰竭和高血压，并且与患者更差的预后相关。然而，到目前为止，迷走神经张力仅能间接测量。此外，关于心率变异性背后的生理机制在文献中一直存在争议：一些人认为心率变异性代表了整体迷走神经活动，而另一些人则认为心率变异性仅由心脏迷走神经活动驱动，或者是由心脏迷走神经传出纤维和压力感受器传入纤维共同驱动。心率变异性，无论是代表整体迷走神经活动还是仅代表迷走神经纤维的一个小部分，也可能由与呼吸相关的阶段性迷走神经活动驱动，而非持续水平。此外，有许多指标可用于测量心率变异性，包括基于时间的、基于频率的和非线性指标。不幸的是，对于最佳心率变异性（HRV）指标尚未达成明确共识，这导致在解读结果时缺乏清晰性。这一情况因许多此类指标之间高度相关而变得更加复杂。在此，通过直接同步测量迷走神经活动和心率，来确定这些 HRV 指标是否与迷走神经的紧张性或阵发性活动存在实际关联。

尽管迷走神经十分重要，但人们对其在正常和病理功能中所起的作用以及迷走神经刺激如何改善部分患者的预后仍知之甚少。此前对迷走神经的生理学研究受到限制，原因在于难以记录迷走神经（以及其他小自主神经）的慢性信号。神经外电极虽然可用于刺激，但信噪比较低，而且在诸如直径约 250 至 500 微米的鼠迷走神经等小自主神经中难以实施。神经内电极能提供更高的信噪比，但许多电极由于相对于神经组织尺寸较大且柔韧性差，导致长期稳定性差和耐用性低。因此，迷走神经的记录主要局限于非存活实验，包括整个神经的记录（使用钩状或环形电极）或单纤维记录。我们之前曾报道过一种用于慢性神经束内记录的新型记录技术，该技术采用碳纳米管纱线（CNTY）电极，在植入大鼠迷走神经后长达 10 周的时间里仍能获得高质量的信号。CNTY 电极体积小（直径 10 微米），柔韧性高且阻抗低，能形成类似轴突的界面，从而在小的自主神经中实现高信噪比的记录。

在本研究中，我们进一步完善了 CNTY 慢性记录方法，改进了电极制造、手术技术、迷走神经信号处理，并开发了一种用于清醒活动动物的慢性记录技术。在此，我们报告了首次在大鼠身上直接进行的自然迷走神经活动的慢性记录结果，以及阐明心率变异性、真实迷走神经张力和呼吸迷走神经活动之间关系的研究成果。

二、结果

01.迷走神经的长期记录

在大鼠迷走神经中进行长期记录一直颇具挑战性，大多数迷走神经研究都是在急性或半慢性条件下进行的。人们曾使用神经外套环电极从迷走神经中急性记录信号；然而，由于神经外膜会衰减神经信号，这些电极的信噪比往往较低，并且只能记录外层轴突的信号。此外，迷走神经的记录通常是在麻醉状态下进行的，而麻醉会影响自主神经活动。因此，我们旨在使用 CNTY 电极在大鼠体内进行有麻醉和无麻醉条件下的迷走神经长期记录。我们之前曾描述过通过将 CNTY 绕在钨制微神经记录针上进行麻醉状态下记录的电极植入方法；在此，我们介绍了一种新的方法，该方法简化了电极的准备和植入过程，同时提高了手术植入的成功率。这些电极的稳定性以及改进的记录装置还使得首次从清醒且处于活动状态的大鼠中记录迷走神经活动成为可能。图 1 展示了采用这种新型缝合方法植入电极的情况，图 2a 展示了慢性清醒记录系统。

图1.使用缝合插入法植入 CNTY 电极。在所有图像中，碳纳米管在左侧，而缝合线在右侧。(a) 非比例示意图展示了整个电极组件。(b) 去绝缘的 CNTY 和将电极固定在缝合线上的渔夫结的详细示意图。(c) CNTY、缝合线和电极的去绝缘部分。比例尺代表 100 微米。一小段聚对二甲苯 - C 通过激光去除。箭头显示将 CNTY 固定在缝合线上的渔夫结，有助于在植入后保持电极就位。(d) 插图显示去除约 200 微米的聚对二甲苯 - C 绝缘层。(e) 植入的 CNTY。比例尺代表 500 微米。箭头显示渔夫结。植入两个电极后，用纤维蛋白胶覆盖电极和神经，以固定电极的位置。

图2.清醒状态下的记录设置和样本数据。红色条显示电极噪声水平（根据电极阻抗和输入放大器噪声计算得出）。(a) 慢性非麻醉记录设置。大鼠的颅骨头盖上安装有连接器，在此连接定制的放大器板（插图）。电缆连接到换向器，使大鼠能够自由活动而电缆不会缠绕或扭曲。使用金属弹簧保护电缆不被啃咬。此设置可用于 24/7 连续记录（紫色光芒是配备红外的相机产生的眩光）。(b) 安静基线，基线之上显著的尖峰很少/没有。这是观察到的最常见的活动类型，尤其是在麻醉状态下。(c) 间歇性尖峰，观察到尖峰但快速出现和消失。(d) 尖峰爆发，长时间的尖峰爆发（幅度和放电频率不同）持续 30 秒或更长时间。(e) 大的间歇性尖峰，短时间内观察到非常大的尖峰（> 100 µV 峰峰值）。这在未麻醉时最常见，但在麻醉时也会出现。(f) 同时记录的心电图。(g) 根据心电图计算出的心率。

使用定制的超低噪声电子设备和连接器头套，对麻醉和清醒状态下活动的实验鼠进行了长达 11 周的迷走神经活动记录（见图 2a）。在清醒和麻醉状态下，所记录的活动均有所变化，包括大量的自发性尖峰活动（单个尖峰以及爆发）。图 2b 展示了基线活动的一个示例；红色方框代表基于电极阻抗和输入放大器噪声估算的峰峰值噪声。尖峰活动在麻醉和清醒状态下均有发生，但在清醒动物中更为常见。图 2c、d 分别展示了短和长尖峰爆发的示例，而图 2e 则展示了大尖峰活动，包括单个尖峰和峰峰值电压超过 100 微伏的短爆发。通过阈值检测（基线均方根的 6 倍）来检测尖峰，并将尖峰的峰峰值与基线均方根进行比较以计算信噪比。平均尖峰信噪比为 16.9 ± 5.4。图 2f 展示了同时记录的心电图示例，图 2g 则展示了相关的心率。所有这些活动类型在麻醉和未麻醉状态下均有观察到，不过未麻醉状态下尖峰、尖峰爆发和大尖峰更为常见，而麻醉状态下安静基线更为常见。由于迷走神经支配着许多器官，因此解读单个尖峰或尖峰群的功能是一项重大挑战。然而，可以计算平均迷走神经活动，从而将测量到的迷走神经张力与心率变异性直接进行比较。

迷走神经张力活动与心率变异性无关 尽管心率变异性测量的生理意义存在一些争议，但许多人认为其是一种可行的临床方法，可用于评估副交感神经（或迷走神经）和/或交感神经张力。然而，对于心率变异性究竟多大程度上能代表整体迷走神经活动，人们知之甚少。我们使用神经内 CNTY 电极对左颈迷走神经进行了长期的迷走神经张力活动测量。在动物维持 2% 异氟烷麻醉状态下，同时记录了 10 分钟的迷走神经神经电图（ENG）和心电图（ECG）。根据电极阻抗（约翰逊噪声）和输入放大器噪声估算每个记录的电极噪声。从每个 10 分钟记录的平均均方根（RMS）中减去该电极噪声，以获得迷走神经张力的测量值。在所有动物中，异氟烷麻醉下的迷走神经张力为 1.03 ± 0.48 微伏均方根（来自 6 只动物的 63 次记录）。使用的 Labchart HRV 模块从心电图记录中计算了常用的心率变异性指标。所使用的 HRV 指标包括 R-R 间期的标准差（SDRR）、心率的标准差（SD Rate）、相邻 R-R 间期差值的均方根（RMSSD）、高频功率（HF）、高频功率占总功率的百分比（HF%）以及低频与高频功率比值（LF/HF）。高频范围定义为 0.5 - 2 赫兹，而低频范围为 0.2 - 0.5 赫兹。这 6 项指标被选中是因为它们是时域和频域中最常用的测量值。其他候选指标（如非线性指标）未被采用，因为它们与所用的 6 项指标之一高度相关。在 6 只大鼠植入后的 1 至 11 周内进行测量，并计算每只大鼠的自主神经活动均方根与 HRV 指标之间的皮尔逊相关性和显著性；所有大鼠的 p 值和平均相关系数见表 1。补充表 1 显示了每只大鼠单独的相关系数和相关 p 值，补充图 1 展示了其中一只大鼠的持续迷走神经活动与所研究的每项 HRV 指标的散点图。在所有 6 只动物身上，均未发现任何心率变异性指标与零值存在显著差异的相关性。

表 1 麻醉基线迷走神经活动与心率变异性的相关性。

麻醉已知会显著改变心率变异性（HRV），异氟烷通常会导致与迷走神经活动相关的 HRV 指标下降。先前的研究表明，全身麻醉会降低迷走神经的总体活动；同时，不同类型的神经纤维表现出不同的行为，既有放电增加的情况，也有放电减少的情况。由于迷走神经活动、HRV 与异氟烷麻醉之间的关系存在不确定性，我们研究了在未麻醉状态下 HRV 与迷走神经张力之间的相关性。从 4 只动物身上收集了未麻醉的记录，重复上述测量，以确定在这些条件下迷走神经张力是否与 HRV 相关。在这种情况下，迷走神经均方根（RMS）在 3 至 10 分钟的时间段内取平均值，记录时间持续 1 至 4 小时。在所有动物中，未麻醉状态下的迷走神经张力为 2.38 ± 2.081 微伏均方根（来自 4 只动物的 358 次记录）——显著高于麻醉状态下的迷走神经张力（两样本 t 检验，p = 5.3E−7）。使用 g 值来衡量未使用异氟烷时迷走神经张力增加的效应大小，得出中等效应大小，g = 0.70。表 2 显示了迷走神经张力与心率变异性（HRV）之间的 P 值和平均相关系数。补充表 2 列出了每只动物的相关系数和相关 P 值，补充图 2 展示了其中一只动物的迷走神经张力与所研究的每个 HRV 指标的散点图。再次强调，所有 4 只动物的 HRV 指标均未发现与迷走神经张力存在显著相关性，尽管第 6 只大鼠的几个 HRV 指标（SDRR、CVRR 和 LH/HF 正相关，HF% 负相关）存在显著相关性。从这些测量结果来看，我们得出结论：清醒和麻醉状态下动物的迷走神经张力与任何 HRV 指标均无一致的相关性，这表明无论是否麻醉，HRV 都不是颈迷走神经张力的有效估计指标。

表 2 非麻醉基线迷走神经活动与心率变异性的相关性。

02.平均迷走神经活动在吸气时比呼气时增加

心率变异性（HRV）的迷走神经/副交感神经成分被认为源于呼吸性窦性心律失常，即吸气和呼气会导致心率的自然变化（心率通常在吸气时增加，在呼气时降低）。因此，HRV 可能不是衡量持续性迷走神经活动的指标，而是与呼吸调节相关的迷走神经阶段性活动。相干平均是一种可应用的技术，通过基于特定控制触发对记录功率进行平均来提高周期性信号的信噪比。在这里，我们使用基于呼吸的触发来检测呼吸不同阶段迷走神经活动的变化。在麻醉状态下，将一个加速度计附着在动物的躯干上，用于测量呼吸，同时记录神经电信号（ENG）和心电图（ECG）。图 3a 展示了一个平均迷走神经均方根（50 毫秒的区间大小）的示例，以及加速度计记录的 10 分钟记录期（497 次呼吸）的平均呼吸轨迹。在异氟烷麻醉下，我们观察到正常呼吸性窦性心律失常的逆转。这种效应如图 3b 所示，其中心率在吸气时降低，在呼气时增加。此外，我们发现与呼气相比，吸气时的平均迷走神经均方根显著增加（图 3c），对 4 只动物的 61 次记录进行配对 t 检验，得出 p 值为 8.4E−7，效应量为科恩 d = 0.67 中等。将吸气时的平均均方根减去呼气时的平均均方根，以获得阶段性呼吸信号的定量测量值。这种呼吸性迷走神经差异（RVD）与预测和测量的肺传入迷走神经活动一致，也可能包括呼吸对其他迷走神经纤维类型的影响。

图3.在麻醉期间呼吸时测量的平均迷走神经活动。(a) 从 10 分钟的记录中获得的样本数据集，显示了平均加速度计轨迹（红色，用于测量吸气和呼气阶段），以及平均迷走神经均方根（蓝色，阴影区域表示 95%置信区间）。(b) 从另一个 10 分钟的记录中获得的样本数据集，显示了平均加速度计轨迹以及平均心率（黑色）。(c) 使用加速度计来指示呼吸（来自 4 只动物的总共 61 个记录）的总麻醉均方根的平均值（左）和吸气与呼气阶段之间的均方根差值（右）。呼吸差值为 0.10±0.15 微伏均方根，与零有显著差异（p = 8.4E−7）。

03.呼吸迷走神经差异可通过心电图估算

由于存在呼吸性窦性心律失常，从心电图中获取呼吸的测量值是可能的。我们研究了是否仅使用心电图和迷走神经 ENG 就能测量 RVD。在正常情况下，心率在呼气时降低，在吸气时升高；而异氟烷麻醉时则相反。图 4 展示了在呼吸过程中如何利用心率变化来平均 ENG 信号，并估算有麻醉和无麻醉时的 RVD。在 50 毫秒的区间内计算迷走神经的均方根值，并且在心率增加（至少 0.25 秒）和心率降低（至少 0.25 秒）期间对这些区间进行平均。样本数据见图 4g、h，而图 5 显示，在吸气期间，无论有无麻醉，迷走神经活动总体上都比呼气时增加（配对 t 检验，p = 1.8E−5，6 只动物的 63 次记录有麻醉，p = 5.4E−6，4 只动物的 358 次记录无麻醉）。对有麻醉和无麻醉时的 RVD 测量了配对样本效应大小，即科恩 d 值。在异氟烷麻醉下，RVD 具有中等效应大小，d = 0.59，而在无麻醉时，只有较小的效应大小，d = 0.24。用加速度计和心率方法测量的 RVD（4 只动物，共 46 次记录）显示加速度计和心率方法之间有高度相关性（R = 0.96，p = 2.3E−26；见补充图 3）。因此，可以从心率估算 RVD。

图4.使用心率来计算呼吸迷走神经差异（RVD）以表征呼吸。（a，b）同时记录心电图（ECG）（a）和迷走神经 ENG（b）。（c）麻醉状态下的心电图用于计算心率。确定心率增加（绿色 - 呼气）和减少（紫色 - 吸气）的时期。（d）将滤波后的迷走神经 ENG 划分为心率增加/减少的时期。（e，f）对于非麻醉状态的记录重复（c）和（d）中描述的步骤，但由于麻醉下 RSA 逆转而倒置。（g）麻醉状态下吸气和呼气期间的平均心率和迷走神经 ENG（显示单个 10 分钟记录的样本数据）。（h）未麻醉状态下吸气和呼气期间的平均心率和迷走神经 ENG（显示单个 10 分钟记录的样本数据）。RVD 计算为 10 分钟内呼气和吸气之间迷走神经 RMS 的差异。

图5.平均张力性均方根（RMS）和呼吸迷走神经差异（RVD）使用心率来指示呼吸。（a）麻醉状态下：平均均方根和 95%置信区间为蓝色，RVD 和 95%置信区间为灰色。从 6 只动物的 63 次总记录中计算出的平均 RVD 为 0.0828 ± 0.14 微伏均方根，这与零有显著差异（p = 1.8E−5）。（b）未麻醉状态下：平均均方根和 95%置信区间为蓝色，RVD 和 95%置信区间为灰色。从 6 只动物的 63 次总记录中计算出的平均 RVD 为 0.15 ± 0.60 微伏均方根，这与零有显著差异（p = 5.4E−6）。

04.呼吸性迷走神经差异与 HRV 不相关

心率的变异性与呼吸密切相关，某些 HRV 指标专门测量呼吸变化。高频成分（HF 和 HF%）专门测量呼吸频率下 HRV 的功率，被认为是迷走神经张力的准确表征。由于呼吸周期与 HRV 之间的这种联系，我们假设与紧张性活动相比，RVD 的大小（测量呼吸期间迷走神经活动的变化）可能是“迷走神经张力”（HRV）的更好预测指标。将有麻醉和无麻醉情况下的 RVD 与平均 HRV 指标进行了比较。表 3 和表 4 显示了所有动物的 p 值和平均相关性。补充表 3 和 4 分别显示了每只动物的相关性和相关 p 值，补充图 4 和 5 显示了有麻醉和无麻醉情况下 RVD 与所研究的每个 HRV 指标的样本散点图。只有两只动物在麻醉下与单个指标显示出显著相关性——大鼠#3 与 RMSSD 呈负相关，大鼠#4 与 HF%呈正相关。在无麻醉情况下，没有动物与任何 HRV 测量值显示出显著相关性。这些数据表明，如 RVD 测量所示，呼吸期间迷走神经活动有明显变化。然而，RVD 与任何 HRV 指标均不相关，这表明 HRV 不是迷走神经中总体阶段性呼吸活动的有效测量指标。

表 3 麻醉状态下呼吸迷走神经差异与心率变异性的相关性。

表 4 非麻醉状态下呼吸迷走神经差异与心率变异性的相关性。

三、讨论

生物电子医学和自主神经疗法是迅速发展的领域，与小自主神经连接的技术对于推进这些学科的研究至关重要。尽管此前的方法在长期记录方面取得了一定的成功，但碳纳米管-水凝胶（CNTY）电极提供了用于慢性外周神经接口的稳定、高信噪比接口。通过这里描述的新型电极制造和准备技术，CNTY 电极现在更易于使用且植入更可靠。麻醉已知会改变心率变异性（HRV）和单个纤维动力学；然而，在没有麻醉的情况下，尚未获得慢性条件下的迷走神经记录。我们首次证明，使用 CNTY 电极可以在清醒、活动的实验大鼠中记录迷走神经张力，极大地扩展了可能的自主神经研究范围。生理学家特别感兴趣的是迷走神经活动、呼吸性窦性心律不齐和心率变异性之间的关系。

呼吸性窦性心律不齐是一种在哺乳动物和其他动物中都存在的众所周知的现象，它将心率变异性与呼吸联系起来。在急性实验中，心脏迷走神经传出纤维的放电频率已被证明与心率呈负相关，并且可用于预测与呼吸性窦性心律不齐相关的心率变化。迷走神经活动还通过副交感神经对心率的控制（通过迷走神经阻断后心率增加的程度来测量）与心率变异性之间存在相关性，以及呼吸引起的心率峰值到峰值的变化来与心率变异性相联系。最初的研究重点在于迷走神经的心脏成分，但此后，心率变异性测量已被用于代表整体迷走神经或副交感神经活动。这一概念可能因将心率变异性改变与非心脏疾病联系起来的研究而得到加强。例如，糖尿病患者的心率变异性高频成分降低。另一项研究显示，慢性阻塞性肺疾病患者的 SDRR 和标准化高频心率变异性降低，并得出结论认为迷走神经活动增加以及对刺激缺乏交感神经反应可能是气道阻塞的原因。多项研究已报道重症监护患者的心率变异性（HRV）降低，且儿童和成人在 HRV 恢复正常后与生存率和总体改善情况相关。另一方面，癫痫患者在发作间期的呼吸心率变异性增加，这表明其可能与大脑的过度活跃有关。因此，HRV 被认为能代表整体迷走神经活动。尽管心脏迷走神经活动的变化可能与其它纤维的活动变化相对应，但我们的数据表明，即使在呼吸周期的平均值上，HRV 也不能代表总的迷走神经活动。

迷走神经刺激（VNS）是一种用于多种疾病的电子刺激疗法，最著名的是用于治疗药物难治性（顽固性）癫痫。尽管 VNS 在多种疾病治疗中取得了不同程度的成功，但其作用机制仍不明确。有一种观点认为，刺激迷走神经可以提高迷走神经张力，从而抵消患者身上出现的一些不良影响。然而，关于刺激右侧和左侧迷走神经对提高心率变异性（HRV）的有效性，研究结果存在冲突。最近，有三项主要的临床试验完成，旨在利用 VNS 来纠正心力衰竭患者的自主神经失衡并改善患者预后。NECTAR-HF、INOVATE-HF 和 ANTHEM-HF 都在研究方案中强调了心率变异性改变的重要性，其中 ANTHEM-HF 和 NECTAR-HF 还测量了 VNS 对心率变异性的影响。尽管这两项研究都观察到某些心率变异性指标有所增加，但所有三项临床试验均未能证明 VNS 治疗对心力衰竭患者有明显益处，尽管此前在狗、大鼠和人类身上曾取得过令人鼓舞的结果。ANTHEM-HF 试验是唯一一项得出总体积极结果的研究，比如左心室射血分数有所改善。即便如此，作者承认安慰剂效应可能影响了他们的结果，还需要进一步的研究。对于迷走神经信号，我们仍有很多未知之处，比如“迷走神经张力是什么？”“迷走神经活动或真正的迷走神经张力与心率变异性（HRV）的临床测量值有何关系？”以及“如何利用迷走神经刺激（VNS）来恢复自主神经功能？”等问题亟待解答。因此，直接记录迷走神经张力对于提高我们研究自主神经疗法的能力以及评估其有效性至关重要。

迷走神经包含多种纤维类型、靶点和来源，其中大多数为传入纤维。因此，迷走神经的持续活动可能同时包含传入和传出神经冲动，且其变化会因生理状态的不同而有很大差异。我们已经证明，在麻醉和未麻醉的大鼠中，直接测量迷走神经张力与常见的心率变异性（HRV）指标之间没有相关性。HRV 被用作预测啮齿动物和人类迷走神经张力的指标，因此这一结果可能适用于人类，并表明临床 HRV 测量并不能代表整体迷走神经活动，和/或“迷走神经张力”这一术语具有误导性。由于迷走神经阻断和迷走神经切断对 HRV 的影响已得到充分证实，所以 HRV 可能与调节其活动以响应生理变化的迷走神经纤维子集有关。HRV 的变化也可能由于下游受体或神经递质的变化而发生，而与神经活动的变化无关。从迷走神经的心脏分支记录信号将有助于更全面地研究心脏迷走神经活动与 HRV 之间的关系。然而，大鼠的心脏分支过于细小且难以触及，该研究可能需要采用更大的哺乳动物模型。这些结果确实为迷走神经刺激（VNS）在心力衰竭治疗中相对缺乏成功和一致性提供了一种潜在的解释，因为在这些研究中，刺激是基于固定开/关周期的，其假设是改变整体迷走神经活动等同于增加心率变异性（HRV）。我们的结果无法解释为何 VNS 在治疗多种其他慢性疾病方面有效，但确实表明这些作用很可能是通过迷走神经中的传入纤维激活而实现的。

单细胞记录显示，心脏迷走神经传出纤维与呼吸性窦性心律失常高度相关。此外，肺迷走神经传入纤维与呼吸相关。然而，此类实验本质上仅能捕捉到迷走神经活动的一小部分，而本研究中呈现的数据则来自神经内的多个不同位置。在小鼠迷走神经中进行的急性全神经记录也显示了与呼吸同步的阶段性活动，这一趋势在这些来自大鼠迷走神经的数据中也得到了明显的重现。使用相干平均来提高信噪比，发现吸气时迷走神经活动较呼气时增强。此前，该技术已与基于心电图的 R 峰触发平均相结合，用于检测急性诱发癫痫发作前迷走神经活动的变化。呼吸迷走神经差异（RVD）是许多纤维平均活动的体现，表明迷走神经放电与呼吸之间存在很强的相关性。然而，RVD 与心率变异性（HRV）之间没有显著相关性，这进一步证明了 HRV 并非迷走神经张力的准确衡量指标。迷走神经干（RVD）信号源自多种类型的迷走神经纤维，例如心脏迷走神经传出纤维、肺部传入纤维（可能是心率变异性反射的一部分）以及检测血压变化的纤维。因此，尽管节律性活动可能是心率变异性（HRV）的主要驱动因素，但其中还包含与心脏控制无关的其他纤维，这解释了为什么迷走神经干活动与心率变异性之间没有直接关联。

作为对迷走神经张力的首次直接研究，这项工作在研究范围上存在一定的局限性。首先，心率变异性（HRV）通常是在非正常生理条件下测量的，比如慢性疾病。可以重复这里描述的实验，使用慢性疾病模型，如心力衰竭、高血压或糖尿病，以确定在这些条件下迷走神经张力是否会发生改变。还可以使用生理干预措施，如运动，来诱发已知的心率变异性变化，并将其与迷走神经记录进行比较。还应研究基于药物和电刺激的疗法，以提供有关这些治疗如何对迷走神经活动产生急性和长期影响的新信息。尽管许多已知会改变迷走神经张力的药物，如阿托品，主要是作用于受体而非迷走神经纤维本身，但它们可能对迷走神经活动产生间接影响。此外，心率不仅受迷走神经控制，还受交感神经系统控制。有一些证据表明，交感神经张力可通过低频心率变异性来测量，交感神经与迷走神经的平衡可通过低频与高频比值来衡量，不过这仍是一个有争议的话题。采用 CNTY 电极进行长期记录，以监测交感神经和迷走神经张力，这将有助于我们更好地理解交感神经和迷走神经系统如何相互作用来控制心率变异性，以及这些系统如何受到病理生理状况和刺激的影响。

总体而言，我们的研究结果表明，现在可以在慢性动物模型中研究迷走神经活动，并提出有关自主神经生理学的新问题。通过直接测量迷走神经活动，我们研究了两种“真实迷走神经张力”的衡量指标：（1）平均迷走神经活动，这是“张力”的最恰当衡量指标；（2）呼吸相位活动，它与心率变化的关系更为密切。由于无论是否存在异氟烷，这两种衡量指标均未显示出与心率变异性指标存在显著相关性，因此我们得出结论，心率变异性不是大鼠迷走神经张力的准确衡量指标。这些结果为未来关于心率变异性确切性质的研究铺平了道路，并可作为研究新型自主神经治疗模式的基础。此外，对 CNTY 电极和记录装置的改进极大地拓宽了在外周神经系统中可开展的研究范围，并可能为迷走神经的研究带来新的突破。

四、方法

01.电极制造

碳纳米管纱线按照先前描述的方法制造。然后，用导电环氧树脂将碳纳米管纱线与不锈钢 35NLT-DFT 丝连接。添加涤纶网和硅橡胶以进一步固定和绝缘碳纳米管-DFT 连接处。碳纳米管纱线的自由端用渔夫结系在 11-0 尼龙缝合线的末端。DFT-碳纳米管纱线-缝合线组件用 5 微米的聚对二甲苯 C 进行涂层，然后使用激光焊机去除一小段（约 200 微米长）的绝缘层。激光设置为 1A 电流、0.3 毫秒脉冲宽度和 300 微米直径。通过测量盐水中记录部位在去绝缘前后的阻抗来确认聚对二甲苯 C 的去除（通常去绝缘前约为 10MΩ，去绝缘后约为 10kΩ）。图 1a、b 展示了电极组件的示意图和去绝缘的记录部位。图 1c、d 展示了碳纳米管纱线-缝合线结和去绝缘的记录部位的特写，图 1e 展示了植入大鼠迷走神经中的电极。

02.手术

所有外科手术和实验程序均在机构动物护理和使用委员会的批准和监督下进行。电极植入 7 至 12 周龄的雄性斯普拉格-道利大鼠体内。

通过沿颈部正中线切开，暴露左侧颈迷走神经。分离颈部左侧的肌肉，以暴露通常相互伴行的迷走神经和颈动脉。将迷走神经从动脉上分离出来，并用玻璃钩将其轻轻拉紧。如图 1e 所示，通过缝合带 CNTY 电极的缝线穿过约 1 至 2 毫米的神经，将两个 CNTY 电极植入神经中。电极植入间距约为 2 毫米。将结穿过神经，然后拉回，使结靠在神经外膜上，记录部位留在神经内部。植入后，用约 1 毫升的纤维蛋白胶覆盖神经及周围组织，以固定电极位置。电极的 DFT 端被引至颅骨顶部，然后焊接到一个连接器上，该连接器用牙科水泥固定在颅骨顶部。放大器接地端连接到颅骨内放置的一个螺钉上。在 8 只动物身上植入了电极以进行长期记录，植入时间从 2 周到 11 周不等。有时实验会提前终止，原因可能是皮肤侵蚀导致隧道导线外露，或者头罩连接器受损，给动物带来疼痛或不适。

心电图遥测仪的植入按照描述进行操作。遥测仪被植入腹部并固定在腹肌上，心电图导联被引导至胸部，其中一根导联置于剑突处，另一根置于胸骨舌骨肌底部附近。迷走神经 CNTY 植入物和心电图遥测仪植入物在一次手术中完成，以尽量减少对动物的影响。

03.记录

记录是在清醒且处于活动状态的动物以及用异氟烷气体麻醉的动物身上进行的。有四只动物仅在麻醉状态下进行了记录，两只动物仅在未麻醉状态下进行了记录，还有两只动物在麻醉和未麻醉状态下都进行了记录（总共 6 只动物在麻醉状态下，4 只在未麻醉状态下）。对于麻醉记录，动物先用 4% 的异氟烷麻醉，然后维持在 2% 的异氟烷和 100% 氧气的环境中。一个四分之一大小的迷你电路板（如图 2a 插图所示）连接到头套上。该电路板通过 Intan RHD2216 记录芯片放大并数字化信号，然后将信号发送到笔记本电脑上进行显示和保存。利用 8 通道硬件平均来进一步提高信噪比。神经记录以 20 千赫兹的采样率进行，并通过 5 千赫兹的低通滤波器。心电图同时以 1 千赫兹的采样率通过生物电位遥测仪进行记录。在某些情况下，将一个加速度计固定在动物的躯干上，以检测呼吸过程中发生的运动。对于清醒状态下的记录，放大器板通过一个定制的 3D 打印的销钉锁定机制固定在头帽连接器上（补充图 6a），并连接到一个换向器，使大鼠能够在笼子里自由活动，如图 2a 所示。这种记录装置也能很好地抵御动物和板的移动（补充图 6b）。在记录过程中，由于会对 ENG 信号造成显著干扰，因此尽可能关闭遥测充电场。遥测充电场处于活动状态的时段，或者 ECG 信号质量差（由于遥测数据包丢失或 EMG 污染）的时段，均未纳入分析。

04.信号处理

将 ENG、ECG 和加速度计数据导入 MATLAB 中进行进一步处理。对 ENG 进行 800-5000 赫兹的带通滤波，以尽量减少来自 EMG、ECG 或其他可能来源的干扰；对 ECG 进行 300 赫兹的低通滤波。从电极阻抗（约翰逊噪声）和输入放大器噪声中估算每个记录的电极噪声，并从平均记录的均方根值中减去该噪声估计值，以估算迷走神经张力的均方根值。对 ECG 数据进行 300 赫兹的低通滤波。通过取连续 R-R 间期的倒数来计算瞬时心率，并进行插值以生成采样率为 1 千赫兹的固定信号。使用 HRV 模块计算 HRV 指标。通常，心跳检测包括 RR 间期为 150-250 毫秒和复杂度为 0-1.8 的心跳（尽管这些值在不同动物和记录日期之间会根据需要进行微调）。异位搏动未纳入分析，且包含异位搏动或伪迹超过 10% 的记录被排除在外，其中伪迹和高噪声（仅出现在未麻醉记录中）是最常见的排除原因。数据以 3 至 10 分钟长的连续片段进行分析，或约 1000 至 3000 个 RR 间期。

05.统计方法

文中结果以平均值±标准差的形式报告，而误差线和阴影区域则代表 95%置信区间（平均值±1.96×标准误）。采用 t 检验来衡量相关性的显著性，经邦费罗尼校正后的显著性水平为 0.0083；采用配对 t 检验来衡量呼吸迷走神经差异的显著性（比较吸气与呼气），采用两样本 t 检验来比较麻醉与非麻醉记录的平均迷走神经张力。所有报告的 p 值均为双侧检验。

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